ПЛР Найпростіші. Розширена діагностика (6 видів, якісне визначення, кал)

Інфекційне ураження організму

Паразитарні інфекції є однією з провідних причин захворюваності та смертності від інфекційної діареї як у країнах, що розвиваються, так і в промислово розвинених регіонах.  
Проблема гіподіагностики: 
• Класичний мікроскопічний аналіз калу має низьку чутливість і високу залежність від людського фактора, через що багато паразитозів залишаються недіагностованими;
• Різноманітність збудників: Одночасна циркуляція багатьох видів найпростіших потребує комплексного підходу, оскільки клінічні прояви різних паразитозів часто ідентичні (діарея, біль у животі, мальабсорбція);
• Групи ризику: Особливу актуальність дослідження має для дітей (де інфекції викликають затримку росту та втрату ваги) та осіб із ослабленим імунітетом (у яких деякі найпростіші викликають тяжкі виснажливі патології). 

Метод мультиплексної ПЛР у реальному часі для виявлення паразитів шлунково-кишкового тракту є стандартом сучасної інфекційно-діагностичної практики.
Високу клінічну цінність цей метод має для тих категорій пацієнтів, де стандартна мікроскопія найчастіше є малоефективною, а наслідки недіагностованої інфекції — критичними:
1. Пацієнти з імуносупресією та онкопатологією
Для осіб із послабленим імунітетом кокцидії (такі як Cryptosporidium spp. та Cyclospora cayetanensis ) є опортуністичними патогенами.
У звичайних пацієнтів ці інфекції викликають помірну діарею, а у хворих на ВІЛ/СНІД, пацієнтів після трансплантації (на імуносупресивній терапії) чи під час хіміотерапії вони зумовлюють важку, виснажливу, профузну діарею , що загрожує. ПЛР дозволяє виявити їх на порядок швидше і точніше, ніж специфічне забарвлення за Цілем-Нільсеном.
2. Діти раннього та дошкільного віку
Діти є головною групою ризику для таких інфекцій, як лямбліоз ( Giardia lamblia ). Через непостійний та хвилеподібний характер виділення цист (період "німого вікна" може тривати тижнями), звичайна мікроскопія калу часто дає хибнонегативні результати.
Хронічний протозооз у дитини веде до синдрому мальабсорбції, гіповітамінозу, затримки фізичного розвитку та хронічної інтоксикації. ПЛР виявляє навіть поодинокі фрагменти ДНК руйнування вегетативних форм.
3. Пацієнти з хронічними гастроентерологічними розладами (потенційний СПК)
Часто пацієнти роками лікуються від "синдрому подразненого кишечника" (СПК), функціональної диспепсії або неспецифічного коліту.
Такі патогени, як Blastocystis hominis та Dientamoeba fragilis , дуже часто пропускаються при рутинному аналізі калу на яйця паразитів. Виявлення їх ДНК дозволяє встановити реальну етіологію хронічного болю в животі, метеоризму та нестійкого випорожнення та повністю вилікувати пацієнта коротким курсом антипротозойної терапії.
4. Мандрівники та туристи («Діарея мандрівників»)
Особи, які повернулися з країн із низьким рівнем санітарії, ендемічних регіонів (Азія, Африка, Південна Америка) або вживали воду з неперевірених джерел.
Затяжна діарея (що триває понад 10–14 днів) у мандрівників найчастіше має саме протозойну етіологію ( Giardia, Entamoeba histolytica, Cyclospora ). Оскільки лікування бактеріальної та паразитарної інфекцій принципово різне, ПЛР допомагає уникнути помилкового призначення стандартних антибіотиків, які лише погіршать стан мікробіоти.
5. Пацієнти з підозрою на амебіаз ( Entamoeba histolytica )
Під мікроскопом неможливо відрізнити патогенну Entamoeba histolytica (яка викликає важку амебну дизентерію та абсцеси печінки ). ПЛР — єдиний доступний метод, який диференціює їх на генетичному рівні, рятуючи пацієнта від непотрібного агресивного лікування або, навпаки, запобігаючи небезпечним ускладненням інвазивного амебіазу.

Основні переваги методу:
• Цільова мультиплексність: одночасне виявлення 6 клінічно значущих найпростіших патогенів ШКТ за один аналітичний цикл.
• Висока аналітична чутливість: гарантоване виявлення збудників навіть за мінімального рівня паразитарного навантаження у зразку.
• Виняткова специфічність: точна ідентифікація найпростіших завдяки таргетному визначенню унікальних ділянок ДНК, що виключає перехресні реакції.
• Подолання обмежень мікроскопії: ефективна діагностика форм найпростіших, які дуже важко чи неможливо візуалізувати за допомогою стандартних мікроскопічних методів (наприклад, диференціація E. histolytica від непатогенних амеб).
• Об'єктивізація результатів: повна незалежність аналізу від суб'єктивного людського фактора та кваліфікації лікаря-лаборанта.
• Оптимізація часу: суттєве прискорення верифікації етіологічного діагнозу для своєчасного початку цільової терапії

Дослідження показане в таких клінічних ситуаціях:
1.Гостра або затяжна діарея нез'ясованої етіології , коли стандартні бактеріологічні посіви калу та експрес-тести на вірусні антигени (рота-, адено-, норовіруси) дали негативний результат.
2.Хронічні шлунково-кишкові розлади тривалістю понад 7–14 днів: регулярний біль чи дискомфорт у животі, стійкий метеоризм, нудота, нестійкі випорожнення (чергування запорів та діареї).
3.Тривалий субфебрилітет (підвищення температури тіла до 37,2–37,5°C) , що супроводжується диспепсичними явищами та непов'язаний із респіраторними інфекціями.
4.Клінічні ознаки синдрому мальабсорбції та синдрому виснаження : незрозуміла втрата ваги, стеаторея, ознаки гіповітамінозу, залізодефіцитна анемія нез'ясованого генезу (особливо у дітей).
5.Діарея мандрівників: поява розладів ШКТ під час або після повернення з країн із тропічним/субтропічним кліматом чи регіонів із низьким рівнем санітарної культури.
6.Скринінг пацієнтів перед початком або під час імуносупресивної терапії , перед трансплантацією органів, курсами хіміотерапії, а також у пацієнтів із ВІЛ-інфекцією/СНІДом при виникненні найменших шлунково-кишкових розладів.
7.Підозра на інвазивний амебіаз чи необхідність диференційної діагностики між патогенною Entamoeba histolytica та непатогенними амебами за наявності ультразвукових чи КТ-ознак абсцесів печінки.
8.Диференційна діагностика із функціональними розладами кишечника , в тому числі через підозру на постінфекційний синдром подразненого кишечника (СПК) для виключення персистуючої протозойної інвазії ( Blastocystis hominis , Dientamoeba fragilis ).
9.Неефективність емпіричної терапії антибіотиками широкого спектра дії при кишкових розладах.
10.Епідеміологічне обстеження контактних осіб у вогнищі протозойних інфекцій (у сім'ях, дитячих дошкільних закладах, школах, інтернатах чи військових частинах) при виявленні спалаху гастроентериту.

Маркер кишкових протозойних інфекцій, що базується на якісному виявленні ДНК клінічно значущих найпростіших у калі методом мультиплексної ПЛР у режимі реального часу.

Клінічна цінність розширеної ПЛР-діагностики полягає в одночасному якісному визначенні 6 ключових збудників з одного зразка калу за один аналітичний цикл: 
1.Blastocystis hominis (BH) – часто зустрічається, доведена його роль у виникненні діарейного синдрому.
2.Giardia lamblia (GL) – збудник лямбліозу, найчастіша невірусна причина діареї у дітей, що веде до мальабсорбції..
3.Dientamoeba fragilis (DF) – патоген, що спричинює гострі та хронічні гастроентерити.
4.Entamoeba histolytica (EH) – збудник амебіазу, потенційно інвазивний патоген, здатний викликати важкі ураження та системні ускладнення.
5.Cyclospora cayetanensis (CC) – викликає гостру діарею як у пацієнтів з нормальним імунітетом, так і у імуносупресивних осіб.
6.Cryptosporidium spp. (CR) – критично небезпечний для осіб із ВІЛ/СНІД та іншими імунодефіцитами, що викликає важкий гастроентерит.

ДНК Blastocystis hominis, ПЛР

Метод: Полімеразна ланцюгова реакція

Референтні значення:

ДНК Giardia lamblia, ПЛР

Метод: Полімеразна ланцюгова реакція

Референтні значення:

ДНК Dientamoeba fragilis, ПЛР

Метод: Полімеразна ланцюгова реакція

Референтні значення:

ДНК Entamoeba histolytica, ПЛР

Метод: Полімеразна ланцюгова реакція

Референтні значення:

ДНК Cyclospora cayetanensis, ПЛР

Метод: Полімеразна ланцюгова реакція

Референтні значення:

ДНК Cryptosporidium spp., ПЛР

Метод: Полімеразна ланцюгова реакція

Референтні значення: