ПЛР (полімеразна ланцюгова реакція): сучасний підхід виявлення інфекційних та генетичних захворювань

1. Що таке ПЛР-тест?
2. Суть підходу та сфери застосування ПЛР-методу
3. Захворювання, які можна діагностувати за допомогою ПЛР
4. ПЛР в гінекології
5. Ціни на ПЛР-діагностику
6. Підготовка до дослідження
7. Як розшифрувати результати ПЛР-дослідження?

Сучасна медицина має безліч методів діагностики, але лише деякі з них дозволяють виявити хворобу навіть тоді, коли симптомів немає. Одним з таких методів є полімеразна ланцюгова реакція (ПЛР) – точне лабораторне дослідження, що здатне «відшукати» у зразку найменшу кількість генетичного матеріалу вірусу, бактерії чи паразита. Саме тому цей метод ідеально підходить для виявлення інфекцій, що передаються статевим шляхом, а також тих, що тривалий час можуть протікати без симптомів.

Що таке ПЛР-тест?

ПЛР-тест – це сучасний лабораторний метод, який дозволяє виявити навіть найменші сліди вірусів, бактерій або інших мікроорганізмів у зразках крові, слизу, слини чи калу. Назва походить від технології, що «розмножує» фрагменти ДНК або РНК збудника, роблячи їх видимими для діагностики.

На відміну від серологічних досліджень, які шукають антитіла, аналіз ПЛР визначає генетичний матеріал інфекції. Це означає, що захворювання можна виявити ще до появи симптомів або на самих ранніх етапах.

Такий метод вважається одним з найточніших у медицині, тому що здатен ідентифікувати конкретний збудник, адже шукає унікальний фрагмент ДНК чи РНК, притаманний саме йому. А тому ПЛР – це «золотий стандарт» при діагностиці вірусних, бактеріальних та інших інфекцій, а також незамінний метод у профілактиці та контролі лікування.

Суть підходу та сфери застосування ПЛР-методу

Метод ПЛР заснований на здатності спеціального ферменту – полімерази, що здатна багаторазово копіювати певні фрагменти ДНК або РНК–збудника. У природних умовах такий процес копіювання відбувається під час клітинного поділу, а в лабораторії він відтворюється штучно за допомогою ампліфікатора (термоциклера) – приладу, який змінює температуру у кілька циклів.

У пробірку зі зразком пацієнта додають спеціальні «інгредієнти»:

1. Праймери: короткі, штучно створені шматочки ДНК, які є «навідниками». Вони розроблені так, що можуть знайти і приєднатися тільки до унікальної ділянки ДНК або РНК конкретного збудника (наприклад, вірусу грипу, а не коронавірусу).
2. Полімераза (Taq-полімераза): термостабільний фермент-«будівельник», який вміє створювати копії ДНК. 
3. Нуклеотиди: «цеглинки» (A, T, C, G), з яких полімераза буде будувати нові ланцюги ДНК.
   ​​​​​​​

Весь процес – це цикл, що складається з трьох температурних етапів і повторюється 30-40 разів.

Крок 1: Денатурація (Роз'єднання). Пробірка нагрівається до 95°C. При такій температурі подвійна спіраль ДНК «розстібається» на два окремі ланцюги.

Крок 2: Відпал (Приєднання праймерів). Температура швидко знижується до 55-65°C. Це дозволяє «навідникам» (праймерам) знайти свої комплементарні ділянки на кожному з двох роз'єднаних ланцюгів ДНК і міцно до них приєднатися.

Крок 3: Елонгація (Синтез). Температура знов піднімається до 72°C – ідеальної для роботи ферменту-будівельника Taq-полімерази. Полімераза «сідає» на праймер і, рухаючись вздовж ланцюга ДНК, добудовує його другу половину, використовуючи вільні «цеглинки» (нуклеотиди).

Наприкінці першого циклу замість однієї молекули ДНК ми маємо вже дві. Далі весь цикл повторюється:

• 2-й цикл: з двох молекул утворюється чотири.
• 3-й цикл: з чотирьох – вісім.
• 4-й цикл: з восьми – шістнадцять.
  ​​​​​​​

Кількість копій зростає в геометричній прогресії. Вже після 30-40 циклів у пробірці утворюються мільярди копій шуканого фрагмента.

Для виявлення цих копій у реакцію додають спеціальні флуоресцентні мітки. Коли створюється нова копія ДНК, мітка вивільняє спалах світла. Спеціальний прилад фіксує це світіння. Якщо світіння є і його інтенсивність зростає з кожним циклом – тест позитивний. Якщо світіння немає – тест негативний.

На кожному етапі молекули ДНК спочатку розділяються, потім до них приєднуються праймери – короткі ділянки, що «вказують» ферменту точне місце для синтезу, після чого створюються їхні копії. Так багаторазове повторення цих циклів збільшує кількість фрагментів настільки, що їх стає можливим виявити та ідентифікувати. Саме тому метод ПЛР полягає в надзвичайно чутливому пошуку генетичного матеріалу збудника, навіть якщо він присутній у мізерній кількості.

Аналітична чутливість ПЛР-тесту є феноменальною – теоретично він може виявити навіть одну копію вірусної РНК у зразку. Однак у реальному житті клінічна чутливість може коливатися, що пов’язано із зовнішніми факторами:

• час тестування – найважливіший фактор. Якщо тест зроблено занадто рано після інфікування (в інкубаційному періоді), вірус ще не встиг розмножитись до кількості, достатньої для виявлення у зразку;
• якість забору матеріалу, адже неправильно взятий мазок (наприклад, недостатньо глибоко з носоглотки) може просто не містити вірусних частинок;
• тип зразка, наприклад, при COVID-19 мазок з носоглотки є більш чутливим, ніж мазок зі слиною;
• умови транспортування та зберігання. Неправильне зберігання зразка може призвести до руйнування РНК вірусу до того, як він потрапить у лабораторію.
  ​​​​​​​

Тому для отримання достовірних результатів слід дотримуватися правил підготовки.

Завдяки високій точності, ПЛР використовують у різних напрямках медицини. У діагностиці інфекцій цей метод дозволяє виявляти віруси, бактерії та паразити задовго до того, як організм почне виробляти антитіла, тому його вважають основним при підозрі на безсимптомне або хронічне носійство.

До основних сфер застосування методу належать:

• гінекологія та репродуктологія: тут зібрані дослідження, що допомагають у діагностиці жіночих захворювань та проблем із фертильністю (приховані інфекції, ВПЛ, фактори безпліддя);
• гепатологія та гастроентерологія: дослідження для діагностики захворювань шлунково-кишкового тракту та печінки (вірусні гепатити, Helicobacter pylori, паразитарні інвазії);
• респіраторні та трансмісивні інфекції, що мають високе епідеміологічне значення та передаються повітряно-крапельним або векторним (через комах) шляхом (туберкульоз, COVID-19, кашлюк, бореліоз);
• молекулярна генетика: розділ повністю відокремлений від інфекцій і фокусується на аналізі ДНК для виявлення спадкових захворювань та схильностей (мутації (наприклад, у генах BRCA), фолатний цикл, спадкові ризики тромбофілії).

Захворювання, які можна діагностувати за допомогою ПЛР

Метод ПЛР дозволяє діагностувати безліч інфекційних захворювань, оскільки він визначає не реакцію організму на збудника, а його реальну присутність у біоматеріалі. Це особливо важливо у випадках, коли інфекція протікає приховано, без яскравих симптомів. За допомогою ПЛР можна виявити як гострі, так і хронічні вірусні та бактеріальні інфекції, що часто становлять небезпеку для здоров’я.

І хоча ПЛР-тестування є «золотим стандартом» у багатьох галузях медицини завдяки своїй винятковій точності, частота його застосування та клінічна роль відрізняються залежно від захворювання.

1. Інфекції, що передаються статевим шляхом (ІПСШ) – основна сфера застосування. Тут ПЛР (та інші методи ампліфікації нуклеїнових кислот, NAATs) є методом першого вибору і застосовується найчастіше. Причина: висока чутливість, що дозволяє виявляти інфекції навіть при безсимптомному перебігу.

• основні інфекції: хламідіоз, гонорея, трихомоніаз та Mycoplasma genitalium. ПЛР є рекомендованим методом для їх діагностики, оскільки дозволяє уникнути ускладнень, таких як безпліддя.
• вірусні інфекції: ПЛР незамінний для виявлення вірусу папіломи людини (ВПЛ) високого онкогенного ризику та для діагностики генітального герпесу (вірусу простого герпесу 1 та 2 типів).
  ​​​​​​​

Центри з контролю та профілактики захворювань США (CDC) рекомендують саме NAATs (включно з ПЛР) як основний метод діагностики для більшості бактеріальних ІПСШ.

2. Моніторинг хронічних вірусних інфекцій. Для таких захворювань, як вірусні гепатити В і С та ВІЛ, кількісний ПЛР-тест («вірусне навантаження») є дуже важливим для:

• підтвердження активної інфекції;
• визначення потреби у лікуванні;
•  моніторингу ефективності противірусної терапії.
  ​​​​​​​

Також ПЛР використовується для діагностики інфекцій, викликаних вірусом Епштейна-Барр та цитомегаловірусом, особливо у пацієнтів з імунодефіцитом.

Всесвітня організація охорони здоров'я (ВООЗ) вказує на ПЛР як на основний метод для підтвердження віремії та контролю лікування гепатиту С.

3. Діагностика гострих інфекцій з високим епідемічним потенціалом. Ця група об'єднує захворювання, швидка та точна діагностика яких важлива для громадського здоров'я.

• респіраторні інфекції: ПЛР був і залишається «золотим стандартом» для діагностики COVID-19, а також широко використовується для виявлення грипу, кашлюку та збудника туберкульозу;
• трансмісивні хвороби: це основний метод для підтвердження хвороби Лайма (бореліозу) на ранніх стадіях шляхом виявлення ДНК борелій у зразку шкіри (біоптаті) або, рідше, в крові. CDC визначає ПЛР як основний метод лабораторного підтвердження COVID-19.
  ​​​​​​​

4.Специфічні застосування в гастроентерології та гінекології. У цих сферах ПЛР є важливим, але не завжди першочерговим інструментом:

• Helicobacter pylori: ПЛР-тест (зазвичай зі зразка біопсії) є високоточним методом, особливо для виявлення стійкості до антибіотиків, що дозволяє одразу призначити ефективне лікування. Однак для первинної неінвазивної діагностики частіше використовують дихательний або каловий антигенний тест.
• кишкові паразити: ПЛР надзвичайно ефективний для виявлення найпростіших (лямблій, криптоспоридій). Для гельмінтів (глистів) «золотим стандартом» залишається мікроскопія калу для пошуку яєць, а ПЛР використовується як додатковий, більш чутливий метод.
• умовно-патогенні інфекції в гінекології: ПЛР може виявити ДНК Gardnerella vaginalis (асоційована з бактеріальним вагінозом) та грибів роду Candida (викликають кандидоз). Однак діагноз цих станів ставиться не за фактом наявності мікроорганізму (оскільки вони можуть бути частиною нормальної мікрофлори), а на основі кількості збудника, клінічних симптомів та результатів мікроскопії.
  ​​​​​​​

Тому ПЛР тут є скоріше допоміжним інструментом у складі комплексних панелей.

ПЛР вважається універсальним, здатним дати відповідь на одне з головних питань: чи є збудник зараз у організмі, і чи потребує людина лікування вже сьогодні.

Але уявіть, що може виникнути така ситуація: ви шукаєте один збудник, а причиною насправді є інший, якщо симптоми хвороби схожі. Чи допоможе в такому випадку ПЛР-тест? Якщо ПЛР-тест налаштований на пошук одного конкретного збудника, а в організмі присутній інший (навіть із дуже схожими симптомами), результат тесту буде негативним.

Простий приклад: якщо у вас кашель і температура, лікар може запідозрити грип і призначити ПЛР-тест на грип. Якщо тест негативний, це означає лише те, що у вас немає вірусу грипу. Причиною симптомів може бути коронавірус, аденовірус, риновірус або будь-який інший респіраторний збудник.

Що робити в таких випадках? Саме для вирішення цієї проблеми існують мультиплексні ПЛР-панелі.

Це один тест, який працює як зв'язка з багатьма різними ключами. В одну пробірку додають набори праймерів одразу до кількох (іноді десятків) найпоширеніших збудників. Наприклад, респіраторна ПЛР-панель може одночасно перевірити зразок на наявність вірусу грипу A і B, SARS-CoV-2 (COVID-19), риновірусу, аденовірусу, респіраторно-синцитіального вірусу (RSV) та інших. Це дозволяє з високою ймовірністю знайти справжню причину захворювання, коли симптоми є неспецифічними.

ПЛР-аналіз – найточніший метод діагностики ЗПСШ

Серед усіх методів діагностики інфекцій, що передаються статевим шляхом (ЗПСШ), саме ПЛР-аналіз вважається золотим стандартом діагностики. Це зумовлено його здатністю виявляти навіть мінімальну кількість збудника задовго до появи симптомів або запальних проявів. На відміну від мікроскопії чи бактеріологічного посіву, ПЛР визначає ДНК або РНК-інфекції, тобто підтверджує її наявність на молекулярному рівні, а не за непрямими ознаками.

У лабораторії ДІЛА за допомогою ПЛР проводиться точна діагностика найпоширеніших урогенітальних інфекцій.

1. Гарднерела вагіналіс, Gardnerella vaginalis, ДНК методом REAL TIME ПЛР - якісн використовується для підтвердження бактеріального вагінозу, коли порушується природний баланс мікрофлори.
2. Уреаплазмоз, Ureaplasma parvum, ДНК методом REAL TIME ПЛР - кількісн., що дозволяє виявити Ureaplasma urealyticum/parvum, збудників, які часто присутні безсимптомно, але впливають на фертильність і можуть бути причиною ускладнень вагітності.
3. Кандидоз, Candida albicans, ДНК методом REAL TIME ПЛР - якісн. застосовується не лише для традиційного виявлення молочниці, а й для глибоких рецидивуючих форм, коли захворювання, спричинене грибками Candida переходять у хронічну фазу.
4. ВПЛ (вірус папіломи людини) – одна з найважливіших інфекцій у гінекології. У ДІЛА доступне комплексне генотипування ДНК 28 типів ПЛР, яке дозволяє не тільки встановити факт інфікування, а й визначити конкретний тип вірусу, включно з високонкогенними (16, 18 тощо).
   ​​​​​​​

Саме ПЛР дозволяє лікарю точно поставити діагноз, розпочати лікування вчасно та запобігти ускладненням. У випадку ЗПСШ це особливо важливо, адже багато хвороб зʼявляються непомітно.

ПЛР-аналіз при інфекційних захворюваннях

ПЛР широко застосовується не лише в діагностиці урогенітальних інфекцій, але й при виявленні інших інфекційних захворювань. Його головна перевага полягає у здатності виявити збудника ще до появи антитіл або клінічних симптомів. Тобто аналіз ПЛР показує, чи є інфекція в організмі саме зараз, а не чи мала людина контакт з нею раніше. Це надзвичайно важливо для своєчасного лікування, контролю ускладнень та запобігання зараженню інших.

1. Гепатит C, РНК вірусу методом REAL TIME ПЛР - кількісн. допомагає не лише підтвердити наявність вірусу, але й визначити вірусне навантаження – кількість копій РНК у крові, що впливає на підбір терапії та оцінку прогнозу. Такий підхід застосовується і при гепатиті В, де ПЛР-тест дозволяє визначити активність і стадію захворювання навіть при нормальних печінкових пробах.
2. ПЛР-тест на ковід (COVID-19) став стандартом діагностики коронавірусу SARS-CoV-2, оскільки дозволяє виявити вірус у перші дні зараження, коли швидкі тести ще можуть бути негативними. Метод також застосовується при підозрі на кашлюк, туберкульоз, бореліоз (після укусу кліща), вірус Епштейна–Барр, цитомегаловірус та інші хронічні інфекції.
3. У гастроентерології ПЛР використовується для виявлення кишкових патогенів. ПЛР калу на кишкові інфекції допомагає швидко встановити збудників сальмонельозу, шигельозу чи ротавірусної інфекції, тоді як ПЛР калу на гельмінти дозволяє діагностувати паразитарні захворювання, які неможливо побачити в мікроскоп або виявити завдяки дослідженню крові. Також ПЛР застосовується для виявлення Helicobacter pylori, бактерії, що викликає виразкову хворобу та гастрити.

ПЛР в гінекології

ПЛР в гінекології має особливе місце, оскільки дозволяє виявити інфекції, які часто протікають безсимптомно, але можуть призводити до серйозних ускладнень – запалень, безпліддя, ураження шийки матки чи ускладнень під час вагітності. Завдяки високій чутливості цей метод здатний виявити навіть мінімальну кількість ДНК-збудника, що робить його одним з найнадійніших для жіночого здоров’я.

ПЛР застосовують для діагностики інфекцій, що передаються статевим шляхом, вірусів папіломи людини (ВПЛ), герпесу, хламідій, уреаплазм, мікоплазм та інших мікроорганізмів.

Особливу увагу приділяють ВПЛ, адже саме він може бути причиною змін у клітинах шийки матки та розвитку передракових станів. Комплексне генотипування ВПЛ за методом ПЛР допомагає визначити конкретний тип вірусу, у тому числі високого онкогенного ризику.

Ціни на ПЛР-діагностику

Вартість ПЛР-діагностики залежить від типу дослідження, збудника, який визначається, та складності проведення. Наприклад, одне дослідження може виявити конкретний вірус чи бактерію, натомість комплексні ПЛР-панелі охоплюють одразу кілька типів інфекцій або генотипування (як у випадку з ВПЛ).

У лабораторії ДІЛА пацієнти можуть обрати як окремий ПЛР-тест (наприклад, ПЛР на гепатит С чи хламідіоз), так і розширені комплекси, що дають повну картину стану здоровʼя.

Хоча ціна ПЛР-тесту може здаватися вищою, ніж досліджень іншими методами, головна його перевага – висока точність і можливість виявити захворювання ще до появи симптомів. Це особливо важливо при ЗПСШ, хронічних вірусних інфекціях і перед плануванням вагітності.

Підготовка до дослідження

Щоб аналіз ПЛР був максимально точним, важливо правильно підготуватися до здачі матеріалу. Підготовка може відрізнятися залежно від типу дослідження (кров, мазок, слина, кал), але є загальні рекомендації, яких варто дотримуватися:

• за добу до дослідження бажано уникати прийому антибіотиків, противірусних або протигрибкових препаратів, якщо інше не погоджено з лікарем;
• для мазків з урогенітального тракту (гінекологічні та урологічні ПЛР): не використовувати вагінальні свічки, антисептики, не проводити спринцювання, утриматися від статевих контактів протягом 48 годин;
• перед ПЛР з ротової порожнини або носоглотки: не їсти, не пити та не чистити зуби за 2–3 години до дослідження;
• для ПЛР калу: матеріал збирається у стерильний контейнер, без використання проносних або клізм.
• для аналізу крові: рекомендується здавати натще (4-8 годин голодування), допускається вода.
  ​​​​​​​

У лабораторії ДІЛА пацієнту надаються всі необхідні інструкції залежно від дослідження. Правильна підготовка гарантує, що ПЛР-тест покаже достовірний результат і дозволить точно визначити наявність або відсутність інфекції.

​​​​​​​

Як розшифрувати результати  ПЛР-дослідження?

Результати ПЛР-досліджень в лабораторії ДІЛА зазвичай видаються у вигляді чіткого висновку: позитивний або негативний, а іноді з додатковою інформацією про вірусне навантаження (кількість вірусних або бактеріальних копій у біоматеріалі):

• негативний результат означає, що ДНК або РНК збудника в досліджуваному зразку не виявлено. Це не виключає можливість контакту з інфекцією раніше, але на момент дослідження активної інфекції немає;
• позитивний результат свідчить про наявність збудника в організмі. У таких випадках лікар оцінює рівень вірусного або бактеріального навантаження та вирішує, чи потрібне лікування або додаткові обстеження.
  ​​​​​​​

ПЛР – це сучасний, швидкий і точний метод діагностики, який дозволяє виявити інфекції ще до появи симптомів. Саме завдяки йому лікар може вчасно призначити лікування та запобігти ускладненням. Проходження ПЛР-дослідження у лабораторії ДІЛА гарантує надійність результатів, швидкі терміни виконання та впевненість у власному здоров’ї.

Усе для турботи про здоров’я – у вашому смартфоні

Оберіть дослідження у застосунку Діла, оформіть замовлення онлайн та отримуйте результати в одному місці. Додавайте близьких і відстежуйте показники в динаміці.

–20% на перше замовлення

Завантажити застосунок